ПЦР-анализ: что это такое, когда он назначается и как проводится

Высокотехнологичные лабораторные методы диагностики дают возможность выявить множество заболеваний на самых ранних стадиях. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) — один из самых новых и точных способов диагностики. За его разработку ученый Кэри Муллис получил в 1993 году Нобелевскую премию. Сегодня этот метод хотя и считается экспериментальным, но уже широко и успешно применяется в медицине.

ПЦР-диагностика: суть подхода

Метод ПЦР использует принципы молекулярной биологии. Его суть заключается в применении особых ферментов, которые многократно копируют фрагменты РНК и ДНК возбудителей болезни, которые находятся в пробах биоматериала, например в крови.

После этого работники лаборатории сверяют полученные фрагменты с базой данных, выявляют тип возбудителя болезни и его концентрацию.

ПЦР проводят в амплификаторе — приборе, охлаждающем и нагревающем пробирки с пробами биоматериала. Нагрев и охлаждение необходимы для проведения репликации. Точность температурного режима влияет на точность результата.

Сферы применения метода

Диагностические возможности метода ПЦР огромны, с его помощью можно выявить самые разные инфекции. Чаще всего ПЦР-метод применяют для диагностики:

  • ВИЧ;
  • герпеса;
  • различных половых инфекций, в частности хламидиоза, уреаплазмоза, гарднереллеза, микоплазмоза и трихомониаза;
  • кандидоза;
  • гепатитов;
  • мононуклеоза;
  • листериоза;
  • цитомегаловируса;
  • туберкулеза;
  • вируса папилломы человека;
  • клещевого энцефалита.

Это далеко не полный список, метод ПЦР-анализа используется в разных областях медицины.

Кстати
Метод ПЦР применяется не только в медицинских целях. В наши дни он используется и в иных сферах, например в криминалистике, в тех случаях, когда требуется определить, кому принадлежит найденный на месте преступления биоматериал. ПЦР иногда используется также при установлении отцовства.

Преимущества и недостатки подхода

У диагностики методом ПЦР много плюсов:

Высокая чувствительность. Метод позволяет выявить возбудителя болезни даже при наличии нескольких молекул его ДНК, то есть на очень ранних стадиях, при хронической форме заболевания, а так же в случаях, когда болезнь никак себя не проявляет, протекая латентно.

Универсальность. Для проведения ПЦР анализа подходит почти любой биоматериал — от крови и слюны до клеток кожи.

Широкий охват. Исследование одного образца может выявить сразу нескольких возбудителей болезни.

Оперативность. Результат, как правило, готов через 5–7 часов, то есть получить заключение можно уже на следующий день после забора биоматериала.

Точность. Метод ПЦР практически никогда не дает ложноположительных или ложноотрицательных результатов, если была соблюдена технология проведения этого анализа.

Невысокая стоимость. По цене ПЦР-анализ сравним с любыми другими лабораторными анализами крови.

Однако следует понимать, что совершенных методов анализа не бывает. У ПЦР есть и минус — высокие требования к соблюдению технологии и к профессионализму лаборантов. Если образец был загрязнен, анализ может дать ложный результат. Поэтому проводить ПЦР-диагностику лучше только в самых лучших лабораториях, где внедрены системы контроля качества работы.

Исследуемый биоматериал

Для ПЦР-диагностики заболеваний на анализ берут разные виды биоматериала. Выбор зависит от типа инфекции. При анализе на ЗППП методом ПЦР берут соскоб или мазок из шейки матки или уретры, а также мочу. Для выявления герпеса, цитомегаловируса, гепатита, токсоплазмоза и ВИЧ на анализ берут кровь. При анализе на мононуклеоз и цитомегаловирус берут мазок из зева. Спинномозговая жидкость используется для анализа при поражениях нервной системы, для диагностики внутриутробных инфекций исследуются ткани плаценты, для выявления легочных инфекций — мокрота или плевральная жидкость.

Подготовка к исследованию

Подготовка к ПЦР-диагностике напрямую зависит от типа биоматериала. Кровь сдается натощак утром. Моча также сдается утром, в лабораторных условиях, в стерильный контейнер. Перед сдачей мазка или соскоба из урогенитальной области нельзя вступать в половые контакты за несколько дней до исследования, не следует проводить спринцевания. Мазок или соскоб нельзя сдавать во время менструации и в течение 2-х дней после ее окончания.

Методы ПЦР-диагностики заболеваний

Существует немало различных методик ПЦР-диагностики: ПЦР в реальном времени, секвенирование, пиросеквенирование, микрофлюидные технологии. Сейчас наиболее распространенным способом проведения анализа является ПЦР в реальном времени — этот метод практически не допускает ложноположительных результатов, к тому же срок обработки образцов при исследовании таким способом сокращается — результат можно получить уже через час.

Расшифровка результатов

Для пациента результат ПЦР-анализа может быть либо положительным, либо отрицательным. Отрицательный означает, что следов враждебной ДНК не обнаружено и человек здоров. Положительный подразумевает наличие фрагментов ДНК возбудителя болезни — это значит, что человек заражен и ему требуется лечение.

Нередко ПЦР-диагностика дает положительный результат, но пациент не чувствует никакого недомогания, а признаки болезни отсутствуют. Однако это означает не ошибку, а очень раннюю стадию заболевания. В этом случае необходимы дополнительные исследования и лечение. Если заболевание было диагностировано на столь ранней стадии, следует начинать терапию как можно скорее, ведь чем дальше зайдет болезнь, тем сложнее будет ее вылечить.

ПЦР-диагностика инфекций невероятно точна — она позволяет обнаружить возбудителя болезни, даже если в пробе находится всего одна-единственная молекула его ДНК. Именно это качество сделало ПЦР-анализ одним из эффективнейших диагностических инструментов как для определения наличия инфекции, так и для контроля за ходом лечения.

Преимущества методики ПЦР

Всего разработано более 10 разных методик амплификации, применяемых лабораториями в зависимости от исходных условий и поставленных целей.
Общим для них есть высокая чувствительность (для положительного результата достаточно 40 (!) или менее искомых копий ДНК в 1 мл образца, то есть вероятность ложноотрицательного ответа ничтожно мала. И очень высокая специфичность: вероятность ложноположительного ответа составляет менее 1%.
Но точность результатов сильно зависит от качества сбора диагностического материала, тщательного соблюдения всех технических требований к каждому этапу и качеству оборудования, расходных материалов (буфера, праймеров, раствора для отмывки и т.д.).

Кому мы обязаны появлением метода ПЦР?

Со слов американского биохимика Керри Мюллиса (Kary Mullis), идея идентифицировать живые организмы по короткому участку их генетического кода (ДНК) пришла ему в голову в 1983 году, по пути с работы домой. А в основе этой идеи, лежала работа другого американского биохимика, Артура Корнберга (Arthur Kornberg), которая в свое время не нашла отклика у научного сообщества.

Керри допустил возможность того, чтобы взять молекулу ДНК какого-либо организма, с помощью высокой температуры «распустить» ее спираль на две нити, специфическими маркерами-праймеры пометить уникальные для этого микроорганизма участки ДНК и затем, применив фермент ДНК-полимеразу, создать из двух нитей две новые молекулы ДНК. Но уже содержащие в себе меченные праймеры. И потом останется просто искать эти участки в диагностическом материале.

В итоге, корпорация CETUS, в которой работал Мюлис, выделила ему команду ученых. И в 1985 году, в издании Американского общества генетики человека, появилась публикация с теоретическим обоснованием ПЦР, как метода идентификации генетического материала живых организмов.

Какой материал используют для диагностики

Для определения вирусных инфекций используется кровь. В редких случаях для анализа берётся моча.

В случае выкидыша у женщины абортивный материал также может быть взят на диагностику для определения причин гибели плода.

ПЦР в гинекологии подразумевает взятие для изучения выделений из половых органов. Забор материала производится из шейки матки. Биологическая субстанция в преддверии влагалища может содержать значительную часть других микроорганизмов и показать неточный результат.

У тех пациенток, которые носят тесное нижнее белье (стринги) или на регулярной основе используют ежедневные гигиенические прокладки, в содержимом влагалища могут оказаться патогены из прямой кишки, что также способно повлиять на результат.

Как его собирают

Для врача-гинеколога забор материала – стандартная процедура. Это похоже на осмотр. Женщина располагается на кресле, используется зеркало. Для взятия секрета берётся мазок при помощи гинекологической щёточки. Она помещается в стерильную колбу, после чего сосуд отправляют в лабораторию для исследования. Ёмкость с материалом может храниться в обычных неподготовленных условиях 1-2 часа. Оптимальная температура хранения – от 4 до 8 градусов по Цельсию.

Нужна ли предварительная подготовка пациентки

Чтобы врач-лаборант смог качественно провести диагностику материала, пациентка должна подготовиться к исследованию. Для этого необходимо придерживаться ряда простых правил:

  • не ходить в туалет за 2 часа до проведения процедуры;
  • половые контакты, трансвагинальное УЗИ запрещены за 24 часа до исследования;
  • антибиотики и противовирусные препараты могут исказить результаты анализа, потому после их приёма должно пройти как минимум 3-4 недели;
  • за 2-3 дня исключить спринцевание;
  • накануне исследования не рекомендуется принимать душ и омывать наружные половые органы;
  • в течение суток не проводить кольпоскопию.

Как проходит аналитический этап диагностики

После забора материал доставляется в лабораторию. Для определения реакции в специальном приборе проводят циклы нагревания и охлаждения с соблюдением точного температурного режима. Для предотвращения испарения материала может применяться вазелин.

Исследование проводится в 3 стадии – денатурация, отжиг и элонгация. Они образуют один полный цикл длительностью 15 минут.

В зависимости от поиска конкретного возбудителя, проводится не менее 30 полных циклов.

Результаты анализа и их расшифровка

Полученные результаты могут носить качественный и количественный характер. Качественное исследование определяет наличие или отсутствие инфекции в организме.

Количественное исследование показывает число молекул ДНК искомого возбудителя. Это необходимо для получения полной картины и подходит для определения количества условно-патогенной микрофлоры (в том числе, не относящейся к ЗППП) или вирусов, которые не требуют лечения при отсутствии симптомов. Возможно исследование биологической субстанции в режиме реального времени, когда оценивают изменение генетического материала в образце.

Достоверность исследования

Достоверность ПЦР-анализа зависит как от подготовки пациентки, так и от опыта лаборанта и условий, в которых проводится исследование. Однако специалистами доказано, что по определению ДНК возбудителя данный метод является одним из самых информативных в современной медицине.

Стоимость анализов в гинекологии

Данный вид анализа может быть проведён как в государственной, так и в частной клинике. ПЦР-диагностика становится всё более доступным методом исследования и в мегаполисах, и в небольших городах. Благодаря относительно низкой стоимости реагентов, ПЦР-анализ является доступным по цене даже в частных медицинских центрах. Цена определения одного возбудителя составляет от 400 до 800 рублей, в среднем ещё 400 рублей берётся за забор материала. Многие клиники предлагают комплекс исследований, в который могут быть включены наиболее распространённые возбудители ИППП и иные патогенные организмы.